【神经遗传】重组微小腺病毒载体对Wilson病患者皮肤成纤维细胞铜代谢的影响

Wilson病(Wilson's disease)是常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病，致病基因为ATP7B基因。Wilson病作为单基因遗传病，最理想的治疗当属基因治疗。基因治疗实验需要合适的载体及模型。微小腺病毒载体(miniAd)因缺乏病毒蛋白的表达，更能满足安全性要求。既往Wilson病基因治疗多是以LEC鼠^[1,2,3]、TX鼠、Atp7b^－/－鼠^[4,5,6,7,8]整体水平或是以它们的离体细胞、Menkes病成纤维细胞系^[9,10]、Wilson病干细胞^[11]等为模型。但动物实验因物种间存在生理差异，限制了其实验结论在人体上的推广^[12]，且动物模型不能解释Wilson病患者间观察到的临床变异性和复杂性，而Menkes病虽亦是铜代谢障碍疾病，但与Wilson病致病基因不同。我们首次以8例原代培养的Wilson病患者皮肤成纤维细胞为模型，以微小腺病毒为载体转染健康人ATP7B基因，更能反映临床Wilson病患者间的差异性和复杂性，以期为Wilson病基因治疗的进一步研究奠定基础。

材料和方法

实验对象

8例Wilson病患者，其中男4例，女4例，年龄11～33岁，均经临床检测及铜生化检测诊断为Wilson病^[13]，并抽取静脉血使用直接测序法检测其突变基因。对照组健康人8名，男4名，女4名，年龄11～46岁，经询问病史及临床铜生化检测排除肝豆状核变性及其他遗传病。

本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均在了解了本研究的目的、方法和风险后，签署了书面的知情同意书。

二、重组微小腺病毒载体的制备

1．扩增引物序列：

ATP7B上游引物：5'－ATAA－GAATGCGGCCGCaccgccATGCCTGAGCAGGAGAGA－CAG－3'；下游引物：5'－CGGGGTACCTCAGATGTAC－TGCTCCTCATC－3'(广州莱德尔生物科技有限公司)。

2．逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)提取人ATP7B基因：

采集健康人静脉血10 ml，离心收集细胞，提取总RNA，使用RT－PCR提取并扩增ATP7B基因，PCR产物切胶回收图如图1。

8例Wilson病患者，其中男4例，女4例，年龄11～33岁，均经临床检测及铜生化检测诊断为Wilson病^[13]，并抽取静脉血使用直接测序法检测其突变基因。对照组健康人8名，男4名，女4名，年龄11～46岁，经询问病史及临床铜生化检测排除肝豆状核变性及其他遗传病。

本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均在了解了本研究的目的、方法和风险后，签署了书面的知情同意书。

二、重组微小腺病毒载体的制备

1．扩增引物序列：

ATP7B上游引物：5'－ATAA－GAATGCGGCCGCaccgccATGCCTGAGCAGGAGAGA－CAG－3'；下游引物：5'－CGGGGTACCTCAGATGTAC－TGCTCCTCATC－3'(广州莱德尔生物科技有限公司)。

2．逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)提取人ATP7B基因：

采集健康人静脉血10 ml，离心收集细胞，提取总RNA，使用RT－PCR提取并扩增ATP7B基因，PCR产物切胶回收图如图1。

图1 使用逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)提取并扩增ATP7B基因的PCR产物切胶回收图

3．PCR回收产物及载体双酶切：

用2个EP管分别取ATP7B PCR回收产物和pDC₃16－mCMV－EGFP载体各15 μl，用NotⅠ与KpnⅠ双酶切，并回收酶切产物。

4．ATP7B与载体连接：

向EP管加入试剂：酶切回收的PCR产物(ATP7B) 3 μl、酶切回收的载体2 μl，10×Ligase缓冲液1 μl，T4 DNA Ligase 1 μl，ddH₂O 3 μl，16 ℃连接2 h。

5．连接产物的转化：

将5 μl连接产物加入50 μl DH5α细胞中，混匀，冰浴30 min，42 °C水浴热休克90 s，冰浴2 min；加入200 μl LB培养基，37 ℃、200转/min振荡1 h；将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素(100 μg/ml)的LB平板上，室温放置至液体吸收；倒置平板，转移入37 ℃培养箱过夜。

6．质粒酶切鉴定阳性克隆：

从平板上挑取若干单克隆于3 ml LB管中摇床过夜，使用高纯质粒小量提取试剂盒提取质粒，NotⅠ/EcoRⅤ双酶切鉴定所提取质粒，酶切产物以含溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳分离，UVP凝胶成像如图2：ATP7B在相应的位置切出一条目的条带(图2箭头)，说明筛到的克隆有3个为阳性克隆，送ATP7B－5号质粒测序，与NCBI上已知序列BLAST 100%一致，因此可用于后续实验。

图2 ATP7B基因的质粒酶切图(箭头为ATP7B目的条带)

三、皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定

皮肤成纤维细胞原代培养方法参考文献[14]，用免疫化学染色鉴定皮肤成纤维细胞，检测人波形蛋白。

四、高铜孵育皮肤成纤维细胞

经检测基本培养液铜离子浓度为2.05 μmol/L，取第6～15代细胞，分别用基本培养液及铜浓度为C₁(22.3 μmol/L)、C₂(89.2 μmol/L)、C₃(156.1 μmol/L)、C₄(245.3 μmol/L)的培养液孵育两组成纤维细胞72 h，每组均孵育3次，然后裂解、离心，收集细胞浆，检测铜与蛋白含量，取3次平均值。

五、腺病毒转染成纤维细胞

转染前预实验已确定病毒最佳感染复数(MOI)为1 000(MOI＝病毒滴度×病毒液体积/细胞数，当MOI为1 000时转染率高且细胞毒现象最小)。设4个组：Wilson病患者未转染组、转染miniAd－GFP组、miniAd－ATP7B－GFP组及健康组。转染miniAd－GFP、miniAd－ATP7B－GFP组均按MOI为1 000加入病毒，4组细胞均用DMEM/F12(铜浓度为C₄：245.3 μmol/L)培养2 h后换为完全培养液(铜浓度为245.3 μmol/L)，于转染后24、48、72、96 h在显微镜下观察转染效率，于72、96 h裂解细胞测铜与蛋白含量。

六、铜与总蛋白含量测定

原子吸收光谱仪法是基于从光源辐射出待测元素特征光波，通过样品蒸汽时，被蒸汽中待测元素的基态原子吸收，由辐射光波强度减弱的程度可测定样品中待测元素含量，使用此方法检测细胞浆铜含量。使用RIPA裂解液提取细胞浆待用；设置好分析条件，向原子吸收光谱仪中加铜系列标准液，以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制出标准曲线；后添加待测样品，测出其吸光度，根据标准曲线算出样品铜浓度。BCA法检测总蛋白含量。

七、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。正态分布的计量资料用均数±标准差(±s)表示，两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较方差不齐时总体采用非参数检验，两两比较采用Games－Howell检验；方差齐性时，总体比较采用方差分析，两两比较采用LSD－t检验。检验水准α＝0.05。