漫谈酶标仪

2021-06-10 14:03:57

欢迎科学仪器销售、试剂耗材销售回家 !

（客服微信：15397161176）

名：酶标仪

字：一台变相光电比色计或分光光度计

号：数据收割机

一.简介

原理

酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本.该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将这一待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号.电信号经前置放大，对数放大，模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果. 。微处理机还通过控制电路控制机械驱动机构X方向和Y方向的运动来移动微孔板，从而实现自动进样检测过程。而另一些酶标仪则是采用手工移动微孔板进行检测，因此省去了X,Y方向的机械驱动机构和控制电路，从而使仪器更小巧，结构也更简单。

微孔板是一种经事先包埋专用于放置待测样本的透明塑料板，板上有多排大小均匀一致的小孔，孔内都包埋着相应的抗原或抗体，微孔板上每个小孔可盛放零点几毫升的溶液.

光是电磁波，波长100nm～400nm称为紫外光，400nm～780nm之间的光可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们之所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收的大部分为红橙光和蓝紫光，但对绿色不吸收，反射出来，所以植物呈现为绿色。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。

随着检测方式的发展，拥有多种检测模式的单体台式酶标仪叫做多功能酶标仪，可检测吸光度（Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光（TRF)、荧光偏振（FP)、和化学发光（Lum)。

酶标仪从原理上可以分为光栅型酶标仪和滤光片型酶标仪。光栅型酶标仪可以截取光源波长范围内的任意波长，而滤光片型酶标仪则根据选配的滤光片，只能截取特定波长进行检测。

检测单位

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示， OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD=log（1/trans），其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系：

E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度， Ιo 为在检测物之前的光强度，Ι为从被检测物出来的光强度。

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

检测值计算

仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换成二进位数字信号，最大为4095。仪器定义没有光源下的透光值为 0%，没有检测物的透光值为100%。则实际检测中，检测物的透光值均在 0%一100%之间。透光值

的计算如下：

T=（Meas—Min）/（Max—Min）

其中T为透光值， Meas为检测的二进位数值， Min为在 0%的情况下检测的二进位数值， Max为在100%的情况下检测的二进位数值，举例如下：

MaX=3600

Min=20

Meas=30

T=（30-20）/3600-20)=0．0028

OD=log（1/T）=log（1/0.0028）=2.552

中心定位

仪器会自动对酶标孔进行中心定位，中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时，仪器其实要进行35个点的测量，选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。

光源的参照通道

参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。

用途和其它提示

用于ELISA试剂的测定，广泛用于各种实验室，包括临床实验室。

质量控制

质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制。

空白校正

有一些试剂盒的说明书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的，请按照试剂盒的说明书要求进行。

检测结果的解释

由于有相当多的因素会影响检测的结果，如不同的酶标板，检测试剂的体积，都会造成OD值的不同，因此，只有使用同一酶标板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行。

酶标仪结构

规格有24孔板，48孔板，96孔板等多种，不同的仪器选用不同规格的孔板，对其可进行一孔一孔地检测或一排一排地检测。

酶标仪所用的单色光既可通过相干滤光片来获得，也可用分光光度计相同的单色器来得到.在使用滤光片作滤波装置时与普通比色计一样，滤光片即可放在微孔板的前面，也可放在微孔板的后面，聚光镜，光栏后到达反射镜，经反射镜作90°反射后垂直通过比色溶液,然后再经滤光片送到光电管.

从酶标仪工作框图和光路图上可看出，它和普通的光电比色计有以下几点差异：

（l）盛装待测比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板.微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，对抗原抗体有较强的吸附作用，故用它作为固相载体.

（2）由于盛样本的塑料微孔板是多排多孔的，光线只能垂直穿过，因此酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的，光束既可是从上到下，也可以是从下到上穿过比色液.

（3）酶标仪通常不仅用A，有时也使用光密度OD来表示吸光度.酶标仪可分为单通道和多通道2种类型，单通道又有自动和手动2种之分.自动型的仪器有X,Y方向的机械驱动机构，可将微孔板L的小孔一个个依次送入光束下面测试，手动型则靠手工移动微孔板来进行测量.

在单通道酶标仪的基础上又发展了多通道酶标仪，此类酶标仪一般都是自动化型的.它没有多个光束和多个光电检测器，如 12个通道的仪器设有 12条光束或 12个光源，12个检测器和12个放大器，在X方向的机械驱动装置的作用下，样品12个为一排被检测.多通道酶标仪的检测速度快，但其结构较复杂价格也较高.

二.工作环境

酶标仪是一种精密的光学仪器，因此良好的工作环境不仅能确保其准确性和稳定性，还能够延长其使用寿命。根据DINVDE0871条例，仪器应放置在无磁场和干扰电压的位置。依据DIN45635－19条例：

1.仪器应放置在低于40分贝的环境下。

2.为延缓光学部件的老化，应避免阳光直射。

3.操作时环境温度应在15℃－40℃之间，环境湿度在15%－85%之间。

4.操作电压应保持稳定。

5.操作环境空气清洁，避免水汽，烟尘。

6.保持干燥、干净、水平的工作台面，以及足够的操作空间。

三.操作事项

酶标仪的功能是用来读取酶联免疫试剂盒的反应结果，因此要得到准确结果，试剂盒的使用必须规范。许多医院在使用酶标仪之前是通过目测判断结果，操作过程随意性较大，在使用酶标仪后如果不能及时纠正操作习惯，会造成较大误差。在酶标仪的操作中应注意以下事项：

1.使用加液器加液，加液头不能混用。

2.洗板要洗干净。如果条件允许，使用洗板机洗板，避免交叉污染。

3.严格按照试剂盒的说明书操作，反应时间准确。

4.在测量过程中，请勿碰酶标板，以防酶标板传送时挤伤操作人员的手。

5.请勿将样品或试剂洒到仪器表面或内部，操作完成后请洗手。

6.如果使用的样品或试剂具有污染性、毒性和生物学危害，请严格按照试剂盒的操作说明，以防对操作人员造成损害。

7.如果仪器接触过污染性或传染性物品，请进行清洗和消毒。

8.不要在测量过程中关闭电源。

9.对于因试剂盒问题造成的测量结果的偏差，应根据实际情况及时修改参数，以达到最佳效果。

10.使用后盖好防尘罩。

11.出现技术故障时应及时与厂家联系，切勿擅自拆卸酶标仪。（擅自拽板是酶标仪损坏的重要原因）

四.常识梳理

为什么酶标仪的标准配置包括405nm,450nm,490nm及630nm四块滤光片具有紫外功能的酶标仪还配备有340nm.

目前用于酶联免疫吸附测定,常使用的标记用酶是辣根过氧化物酶(HRP)，对应的底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)。底物在过氧化氢溶液的存在下，经辣根过氧化物酶作用，分别氧化为2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。邻苯二胺(OPD)的氧化产物DAB,在pH值为5．0左右时，在450nm波长处有大吸收，此时可用450nm的滤光片测定吸光值。当加入强酸作为终止试剂终止反应时，pH值降到接近0，此时大吸收波长移至492nm，此时可用492nm的滤光片测定吸光值。

四甲基联苯胺(TMB)的氧化产物联苯醌，一般在波长为450nm处有大消光系数。使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min，便于检测。因此，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定常用的。有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。

除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，双波长比色主要用于消除非特异干扰的影响。

如果实验需要用酶标仪作微量生化测定，就需要扩展紫外检测功能，此时需要一个340nm波长滤光片。

总之，以上介绍的是常用的几个波长的滤光片，用户还可以根据自己的需求选择其他波长的滤光片。一般各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6～8片滤光片，可以满足用户的不同需求。

2.酶标仪分类

A.按照功能的划分,酶标仪可以分为光吸收酶标仪,荧光酶标仪,化学发光酶标仪和多功能的酶标仪.

光吸收酶标仪是用来进行可见光与紫外光吸光度的检测.特定波长的光通过微孔板中的样品后,光能量被吸收,而被吸收的光能量与样品的浓度呈一定的比例关系,由此可以用来定性和定量的检测.光吸收的检测技术成熟,成本低,操作简单,但是动态范围窄,灵敏度比较低,特异性不强.一般可见光和紫外光分别采用钨灯及氘灯作为光源,发展的主流是LED光源，而紫外/ 可见酶标仪是可以将两种光源进行切换，适应不同测量波长的需求。

荧光酶标仪是用来进行荧光的检测.通过激发光栅分光后的特定波长的光照射到被荧光物质标定的样品上后,会发出波长更长的发射光,通过发射光栅后到达检测器.荧光的强度与样品的浓度呈一定的比例.荧光检测灵敏度高,可实时检测,使用方便,检测模式多样,但是容易受外界干扰,激发光与发射光容易互相影响,干扰检测.

化学发光是来自生物化学反应中的自发光,可分为辉光型和闪光型两种类型.辉光型发光持久,稳定,能持续一段时间;闪光型发光时间短,变化快,稳定性不强,需要应用自动加样器才可以进行.化学发光中发出的光子数与样品量呈一定比例关系,化学发光酶标仪灵敏度非常高,动力学范围广.

多功能酶标仪是以上三种酶标仪的集合,它集成了两种或者三种酶标仪于一体,可以同时进行光吸收,荧光和化学发光的检测,功能强大,使用范围广,可作为研究平台,避免了重复购买.

B.酶标仪基于滤光方式的不同可分为滤光片式的酶标仪和光栅式酶标仪.

滤光片式酶标仪采用滤光片来进行波长的选择,酶标仪内置滤光片轮,可选择试验所需的不同波长的滤光片来进行分光,光源发出的全波谱光经过滤光片后,大部分被过滤,只剩下滤光片本身允许的波长通过,这样就可就通过滤光片来获得特定的波长.滤光片轮一般包含4-6块滤光片,通过选择不同的滤光片可获得不同的波长,但是获得的波长都是固定的,受到一定的限制,不能获得任意所需的波长,而且更换滤光片价格比较昂贵.

光栅式酶标仪虽然才出现短短十年,但是发展非常迅猛,现在已经是主流的酶标仪.它采用光栅进行分光,光源发出的全波谱光线经过光栅后,通过光栅上面分布的一系列狭缝的分光,就可以获得任意波长的光，波长连续可调，一般递增量为1nm.光栅式酶标仪使用方便灵活,可以通过软件选择任意波长的光,而且可以进行全波长的扫描,通过全波长扫描可以获得未知样品的吸收峰,从而可以达到检测未知样品的目的,在实验室中很受欢迎,可以进行更多实验的检测.因此目前在国内的普及程度很高.

C.另外根据通道的个数，可以将酶标仪分为单通道和多通道酶标仪，单通道又有自动和手动之分。

五.市面上的品牌

进口品牌

Tecan

Biotek

ThermoFisher

Bio-Rad

Berthold

DYNEX

IOM

Anthos

国产品牌